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Home Chimica Organica

Determinazione degli amminoacidi in una proteina

di Chimicamo
8 Novembre 2022
in Chimica Organica, Chimica
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Determinazione degli amminoacidi in una proteina- chimicamo

Determinazione degli amminoacidi in una proteina- chimicamo

Per la determinazione  della sequenza ordinata degli  amminoacidi presenti in una proteina è fatta un'analisi per la determinazione sia qualitativa che quantitativa degli amminoacidi presenti. Il metodo consiste di due fasi:

1)      Idrolisi di una quantità nota di proteina

2)      Separazione degli amminoacidi

Idrolisi

L'idrolisi è fatta riscaldando la proteina a 100-100 gradi centigradi in HCl 6 N per un tempo di circa 24 ore. Le proteine contenenti molti gruppi idrofobi ingombranti possono richiedere un tempo maggiore.

Il triptofano, tuttavia, è sensibile agli acidi ed è parzialmente distrutto nell'idrolisi, fenomeno che si deve tener presente nell'analisi quantitativa. Inoltre, se vi sono glutammina e asparagina si isola ammoniaca , acido glutammico e acido aspartico.

Separazione

La miscela di amminoacidi ottenuta per idrolisi può essere separata e analizzata usando tecniche cromatografiche. Nell'analizzatore sono introdotte delle aliquote della miscela di amminoacidi dentro colonne separate costituite da resine a scambio ionico. Una colonna è mantenuta a pH 5.3 e viene usata per la determinazione degli amminoacidi basici, per l'ammoniaca e il triptofano.

Una seconda colonna è mantenuta a pH 3.25 per gli altri amminoacidi fino a che sono passati da 0 a 250 mL di eluente. Quindi il pH è aumentato fino a pH pari a  4.25 facendo passare da 250 a 500 mL di eluente. Si eluiscono poi gli acidi fissati nella colonna con una soluzione tampone di citrato di sodio e le soluzioni così eluite sono mescolate con ninidrina e poi scaldate.

LEGGI ANCHE   Le proteine e loro struttura

La ninidrina è un indicatore altamente specifico per il rilevamento degli amminoacidi in quanto reagisce con essi dando una colorazione azzurro-violetto ( assorbimento a 570 nm), tranne che con la prolina che, essendo un amminoacido ciclico e presentando quindi un'ammina secondaria forma con la ninidrina un complesso giallo (assorbimento a 440 nm). La reazione tra la ninidrina e un amminoacido avviene secondo il seguente schema:

 

ADVERTISEMENTS

450px Ninhydrin Reaction Mechanism.svg 1Una volti separati i vari amminoacidi, dopo il trattamento con la ninidrina si presentano di colorazioni diverse a seconda dell'amminoacido che ha reagito:

100 2566 1

 

Analisi spettrofotometrica

Uno spettrofotometro misura l'assorbimento ottico dei prodotti di reazione con la ninidrina e un registratore riporta in continuo i millilitri di eluato contro l'intensità del colore della ninidrina.

La posizione del picco di assorbimento che dipende dal volume di soluzione tampone necessario per eluire un determinato amminoacido è caratteristica per ciascun amminoacido il che consente un'analisi qualitativa. Inoltre poiché la concentrazione di ciascun amminoacido è proporzionale all'assorbanza della soluzione, le rispettive quantità sono ottenute dalla misura dell'area sottostante il picco (analisi quantitativa)

Dalla figura si possono osservare i picchi caratteristici di alcuni amminoacidi

 

1 s2.0 S0300483X11004975 gr4 1

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Tags: amminoacidiidrolisininidrinaprolinaproteine

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Il Progetto Chimicamo

Massimiliano Balzano, ideatore e creatore di questo sito; dottore di Scienza e Ingegneria dei Materiali presso l’Università Federico II di Napoli. Da sempre amante della chimica, è cultore della materia nonché autodidatta. Diplomato al Liceo Artistico Giorgio de Chirico di Torre Annunziata.


Maurizia Gagliano, ha collaborato alla realizzazione del sito. Laureata in Chimica ed iscritta all’Ordine professionale. Ha superato il concorso ordinario per esami e titoli per l’insegnamento di Chimica e Tecnologie Chimiche. Docente.

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