Per la determinazione della sequenza ordinata degli amminoacidi presenti in una proteina è fatta un’analisi per la determinazione sia qualitativa che quantitativa degli amminoacidi presenti. Il metodo consiste di due fasi:
1) Idrolisi di una quantità nota di proteina
2) Separazione degli amminoacidi
Idrolisi
L’idrolisi è fatta riscaldando la proteina a 100-100 gradi centigradi in HCl 6 N per un tempo di circa 24 ore. Le proteine contenenti molti gruppi idrofobi ingombranti possono richiedere un tempo maggiore.
Il triptofano, tuttavia, è sensibile agli acidi ed è parzialmente distrutto nell’idrolisi, fenomeno che si deve tener presente nell’analisi quantitativa. Inoltre, se vi sono glutammina e asparagina si isola ammoniaca , acido glutammico e acido aspartico.
Separazione
La miscela di amminoacidi ottenuta per idrolisi può essere separata e analizzata usando tecniche cromatografiche. Nell’analizzatore sono introdotte delle aliquote della miscela di amminoacidi dentro colonne separate costituite da resine a scambio ionico. Una colonna è mantenuta a pH 5.3 e viene usata per la determinazione degli amminoacidi basici, per l’ammoniaca e il triptofano.
Una seconda colonna è mantenuta a pH 3.25 per gli altri amminoacidi fino a che sono passati da 0 a 250 mL di eluente. Quindi il pH è aumentato fino a pH pari a 4.25 facendo passare da 250 a 500 mL di eluente. Si eluiscono poi gli acidi fissati nella colonna con una soluzione tampone di citrato di sodio e le soluzioni così eluite sono mescolate con ninidrina e poi scaldate.
La ninidrina è un indicatore altamente specifico per il rilevamento degli amminoacidi in quanto reagisce con essi dando una colorazione azzurro-violetto ( assorbimento a 570 nm), tranne che con la prolina che, essendo un amminoacido ciclico e presentando quindi un’ammina secondaria forma con la ninidrina un complesso giallo (assorbimento a 440 nm). La reazione tra la ninidrina e un amminoacido avviene secondo il seguente schema:
Una volti separati i vari amminoacidi, dopo il trattamento con la ninidrina si presentano di colorazioni diverse a seconda dell’amminoacido che ha reagito:
Analisi spettrofotometrica
Uno spettrofotometro misura l’assorbimento ottico dei prodotti di reazione con la ninidrina e un registratore riporta in continuo i millilitri di eluato contro l’intensità del colore della ninidrina.
La posizione del picco di assorbimento che dipende dal volume di soluzione tampone necessario per eluire un determinato amminoacido è caratteristica per ciascun amminoacido il che consente un’analisi qualitativa. Inoltre poiché la concentrazione di ciascun amminoacido è proporzionale all’assorbanza della soluzione, le rispettive quantità sono ottenute dalla misura dell’area sottostante il picco (analisi quantitativa)
Dalla figura si possono osservare i picchi caratteristici di alcuni amminoacidi
