Determinazione degli amminoacidi in una proteina

Prima di determinare la sequenza ordinata degli  amminoacidi presenti in una proteina viene fatta un’analisi per la determinazione qualitativa e quantitativa degli amminoacidi presenti. Il metodo consiste di due fasi:

1)      Idrolisi di una quantità nota di proteina

2)      Separazione degli amminoacidi

L’idrolisi viene fatta riscaldando la proteina a 100-100 gradi centigradi in HCl 6 N per un tempo di circa 24 ore. Le proteine contenenti molti gruppi idrofobi ingombranti possono richiedere un tempo maggiore. Il triptofano, tuttavia, è sensibile agli acidi e viene parzialmente distrutto nell’idrolisi, fenomeno che si deve tener presente nell’analisi quantitativa. Inoltre, se sono presenti glutammina e asparagina si isola ammoniaca , acido glutammico e acido aspartico.

La miscela di amminoacidi ottenuta per idrolisi può essere separata e analizzata usando tecniche cromatografiche. Nell’analizzatore vengono introdotte delle aliquote della miscela di amminoacidi dentro colonne separate costituite da resine a scambio ionico. Una colonna viene mantenuta a pH 5.3 e viene usata per la determinazione degli amminoacidi basici, per l’ammoniaca e il triptofano.

Una seconda colonna viene mantenuta a pH 3.25 per gli altri amminoacidi fino a che sono passati da 0 a 250 mL di eluente. Quindi il pH viene aumentato fino a pH pari a  4.25 facendo passare da 250 a 500 mL di eluente. Si eluiscono poi gli acidi fissati nella colonna con una soluzione tampone di citrato di sodio e le soluzioni così eluite vengono mescolate con ninidrina e poi scaldate.

La ninidrina è un indicatore altamente specifico per il rilevamento degli amminoacidi in quanto reagisce con essi dando una colorazione azzurro-violetto ( assorbimento a 570 nm), tranne che con la prolina che, essendo un amminoacido ciclico e presentando quindi un’ammina secondaria forma con la ninidrina un complesso giallo (assorbimento a 440 nm). La reazione tra la ninidrina e un amminoacido avviene secondo il seguente schema:

reazione degli amminoacidi con ninidrina

Una volti separati i vari amminoacidi, dopo il trattamento con la ninidrina si presentano di colorazioni diverse a seconda dell’amminoacido che ha reagito:

amminoacidi in ninidrina

Uno spettrofotometro misura l’assorbimento ottico dei prodotti di reazione con la ninidrina e un registratore riporta in continuo i millilitri di eluato contro l’intensità del colore della ninidrina.

La posizione del picco di assorbimento che dipende dal volume di soluzione tempone necessario per eluire un determinato amminoacido è caratteristica per ciascun amminoacido il che consente un’analisi qualitativa. Inoltre poiché la concentrazione di ciascun amminoacido è proporzionale all’assorbanza della soluzione, le rispettive quantità sono ottenute dalla misura dell’area sottostante il picco (analisi quantitativa)

Dalla figura si possono osservare i picchi caratteristici di alcuni amminoacidi

analisi spettrofotometrica di amminoacidi

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Author: Chimicamo

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