Uno dei metodi più comuni per la determinazione delle proteine totali contenute in un campione è il metodo del biureto noto anche come test di Piotrowski in onore del fisiologo polacco Gustaw Piotrowski.
Sintesi del biureto
Il biureto è un composto ottenuto dalla reazione di condensazione dell’urea che è riscaldata ad una temperatura di 180°C con eliminazione di ammoniaca:
2 H2NCONH2 → H2NCONHCONH2 + NH3
Reazioni
Quando il biureto è trattato con solfato di rame di colore azzurro in ambiente alcalino, si forma un complesso di colore viola. In esso lo ione Cu2+ coordina, tramite il doppietto elettronico solitario presente sull’azoto quattro atomi di azoto provenienti da legami peptidici.
La reazione quindi dipende dalla presenza di legami peptidici ed è quindi positiva con i polipeptidi e quindi con le proteine.
La variazione di colore è funzione del numero di legami peptidici presenti nella soluzione. Quindi l’analisi quantitativa delle proteine può essere effettuata tramite metodi spettrofotometrici tenendo conto che il complesso assorbe a 540 nm.
Poiché in ambiente basico lo ione rame (II) precipita come idrossido Cu(OH)2 viene aggiunto il sale di Rochelle per stabilizzare lo ione rame. Inoltre è aggiunto ioduro di potassio onde evitare la riduzione dello ione rame.
Dopo aver preparato la soluzione del reattivo aggiungendo 3 g di solfato di rame pentaidrato e 9 g di sale di Rochelle a 500 mL di una soluzione 0.2 M di NaOH si aggiungono 5 g di KI. La soluzione risultante è portata a volume di 1 L con NaOH 0.2 M.
Per ottenere la retta di taratura si prepara una soluzione di albumina siero di bovino con concentrazione 10 mg/mL e da questa si preparano soluzioni più diluite. Si misura l’assorbanza di ciascuna soluzione a 540 nm e si costruisce la retta di taratura.
La concentrazione delle proteine in una massa nota di campione incognito è determinata conoscendo la sua assorbanza interpolandone graficamente il valore.