AscoltaLa legge di Lambert-Beer stabilisce una relazione tra l'estinzione e la concentrazione della sostanza disciolta ed è alla base dell'analisi chimica quantitativa.
Quando una radiazione luminosa incide su un mezzo trasparente, in parte viene riflessa, in parte si rifrange nel mezzo. L'intensità di questa frazione diminuisce man mano che la radiazione si propaga, per cui all'uscita risulterà inferiore.
Detta Io è l'intensità della luce incidente e I è l'intensità della luce che fuoriesce il rapporto I/Io è definito come trasmittanza complessiva del mezzo .
Il logaritmo decimale del reciproco della trasmittanza prende il nome di estinzione o assorbanza:
A = log 1/T = log Io/I
Legge di Lambert-Beer
La legge di Lambert-Beer stabilisce una proporzionalità diretta tra l'assorbanza e la concentrazione della specie assorbente:
A = log Io/I = abc
Dove a è una costante di proporzionalità, chiamata assorbanza specifica, b è lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione espresso in centimetri, c la concentrazione della sostanza assorbente nella soluzione. Se quest'ultima è espressa in mol/L , l'assorbanza specifica prende il nome di coefficiente di estinzione molare, ε e, di conseguenza, A = εbc
Nel caso si possa dimostrare linearità fra assorbanza e concentrazione si ha a disposizione un metodo di analisi quantitativo per assorbimento nell'ultravioletto e visibile. La linearità si verifica, di solito, in ristretti intervalli di concentrazione La relazione lineare di proporzionalità tra A e c, in realtà, non è più verificata al crescere della concentrazione; infatti si possono verificare deviazioni dalla legge di Lamber-Beer con scarsa attendibilità del dato analitico.
Dunque tale legge è valida per soluzioni diluite: noto il coefficiente di estinzione molare e lo spessore della soluzione, una volta determinata per via strumentale l'assorbanza si può ottenere la concentrazione della soluzione. Abitualmente si procede nella costruzione di una retta di taratura: viene misurata l'assorbanza di soluzioni a titolo noto e si riportano in grafico tali punti sperimentali ponendo in ascissa la concentrazione e in ordinata l'assorbanza. Se la soluzione è diluita tali punti si allineano lungo una retta che costituisce la retta di taratura anche detta retta di lavoro: la concentrazione di una soluzione incognita viene determinata per interpolazione conoscendone l'assorbanza.
Esercizi svolti
1) Una sostanza mostra il massimo di assorbanza a 275 nm. Sapendo che ε275 = 8400 M-1 cm-1 e lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione è di 1 cm calcolare la concentrazione di una soluzione di tale sostanza se A275 = 0.70
Applichiamo la legge di Lambert-Beer:
A = εbc
e sostituendo i valori si ha:
0.70 = 8400 M-1 cm-1 ∙ 1 cm ∙ c
Da cui c = 8.33 ∙ 10-5 M
2) In una soluzione sono presenti 4 g/L di una sostanza. Sapendo che lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione è di 2 cm e che solo il 50% di radiazione incidente viene trasmessa calcolare il coefficiente di estinzione molare. Calcolare inoltre la luce trasmessa se la concentrazione è di 8 g/L.
Sappiamo che A = log Io/I quindi sostituendo si ha:
A = log 1.0/0.5 = 0.30
Applichiamo la legge di Lambert-Beer:
A = εbc
e sostituendo i valori si ha:
0.30 = ε ∙2 ∙ 4 = 8ε
Da cui ε = 0.0376
Se la concentrazione è di 8 g/L si ha:
A = 0.0376 ∙ 2 ∙ 8 = 0.60
A = 0.60 = log Io/I = log 1 – log I = 0 – log I
Quindi log I = – 0.60 e quindi I = 10-0.60 = 0.25 quindi la luce trasmessa è il 25% rispetto a quella incidente
3) Il coefficiente di estinzione molare di una soluzione è pari a 0.20 a 450 nm. Calcolare la concentrazione della soluzione se la luce trasmessa è il 40% e lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione è di 2 cm.
Si ha:
log 1/ 0.40 = A = 0.398
0.398 = 0.20 ∙ c ∙ 2
Da cui c = 0.995
4) La citosina ha un coefficiente di estinzione molare di 6 ∙ 103 a 270 nm ad un valore di pH uguale a 7. Calcolare l'assorbanza e la percentuale di luce trasmessa quando la concentrazione della soluzione è 1 ∙ 10-4 M e quando la concentrazione della soluzione è 1 ∙ 10-3 M e e lo spessore della soluzione attraversato dalla radiazione è di 0.1 cm
Quando la concentrazione è 1 ∙ 10-4 M l'assorbanza è data da:
A = 6 ∙ 103 ∙0.1 ∙ 1 ∙ 10-4 = 0.06
A = log Io/I da cui 0.06 = log Io/I
Ovvero Io/I = 100.06 =1.15
Si ha I/Io = 1/1.15 =0.870
Quindi la luce trasmessa è l'87.0% rispetto a quella incidente
Analogamente se la concentrazione della soluzione è concentrazione è 1 x 10-3 M l'assorbanza è data da:
A = 6 ∙ 103 ∙ 0.1 ∙ 1 ∙ 10-3 = 0.6
Ovvero Io/I = 100.6 =3.98
Si ha I/Io = 1/3.98 =0.251
Quindi la luce trasmessa è il 25.1% rispetto a quella incidente
5) Una proteina ha un coefficiente di estinzione molare pari a 16 e un'assorbanza di 0.73 se spessore della soluzione attraversato dalla radiazione è di 0.5 cm. Calcolare la concentrazione della soluzione
Dall'equazione A = εbc si ha:
c = A/εb = 0.73 / 16 ∙0.5 = 0.091 g/100 mL
