AscoltaLa cromatografia su strato sottile TLC (Thin layer chromatography) è un metodo microanalitico che trova applicazioni sia su scala analitica che preparativa. La cromatografia su strato sottile infatti consente di estendere le tecniche della cromatografia su carta a gli adsorbenti adoperati nella cromatografia su colonna sommandone i rispettivi vantaggi.
Nelle sue linee fondamentali essa non è altro che una cromatografia in cui l'adsorbente o il sistema di ripartizione è costituito da uno strato sottile di materiale distribuito su una lastra di vetro o di alluminio.
La separazione delle sostanza sullo strato sottile avviene in modo rapido e con buona risoluzione. Le piccole quantità di sostanza richieste e la velocità con cui si ottengono i cromatogrammi rendono questa tecnica utile per indagini preliminari e di routine.
Strato adsorbente
La problematica maggiore che si incontra nella tecnica è quella della preparazione dello strato adsorbente che deve essere distribuito uniformemente e con spessore rigorosamente costante sul supporto.
Il materiale adsorbente, usato sotto forma di pasta, viene disteso in sottile strato sulla lastra facendo uso di uno stratificatore che consente una distribuzione corretta su lastre di vetro standard ( 20 cm∙20 cm) o su strisce di vetro ( 5 cm∙20 cm). Lo spessore del materiale adsorbente deve oscillare tra 50 e 300 μ e, a seconda del miscuglio da separare, si possono preparare strati acidi, basici o tamponati in un dato intervallo di pH.
Successivamente alla stesura le lastre vengono poste in stufa in modo che venga eliminata l'acqua in eccesso e si formi uno strato compatto e resistente. Tali lastre, dopo l'essiccamento in stufa a 150°C devono essere conservate in essiccatore al fine di evitare che adsorbano acqua. L'applicazione del campione sulla lastra viene condotta con una micro pipetta o con una micro siringa tarata in microlitri.
Eluente
Dopo che il solvente della macchia è evaporato, le lastre vengono poste in una vasca con coperchio a tenuta contenenti l'eluente ed immerse per circa 0.5 cm. L'eluente si muove per capillarità lungo lo strato in senso ascendente. Man mano che l'eluente risale lungo la lastrina si ha una ripartizione del campione in base alla diversa affinità fra la fase stazionaria e quella mobile.
La scelta dell'eluente è molto importante e decisiva ai fini di una buona riuscita dell'analisi. Una regola fondamentale per tale scelta impone l'adozione di solventi tanto più polari quanto più polare è la sostanza da eluire.
Adsorbenti
Gli adsorbenti più comuni che sono utilizzati nella cromatografia su strato sottile sono il gel di silice, l'allumina, il kieselguhr ( terra infusoria) e la cellulosa polverizzata. Gel di silice e allumina hanno rispettivamente caratteristiche acide e basiche mentre le terre infusorie hanno caratteristiche neutre.
L'allumina è adatta alla separazione di sostanze basiche non polari o di miscele neutre, mentre il gel di silice è indicato per sostanze acide non polari. Tra gli adsorbenti meno comuni ricordiamo: polvere di resine poliammidiche, cellulosa modificata, solfato di calcio, polietilene, ossido di magnesio e carbonato di zinco.
Quasi nella totalità dei casi gli adsorbenti sono impiegati previa aggiunta di piccole quantità di additivi con lo scopo di ottenere uno strato più compatto e meglio distribuito sulla lastra di vetro. L'additivo più comune è il gesso di Parigi CaSO4· ½ H2O (solfato di calcio semiidrato) che può essere addizionato al materiale adsorbente fino al 20% in peso. Il potere eluente di un solvente può essere valutato sulla base delle seguenti regole empiriche:
– Gli idrocarburi saturi non sono adsorbiti o lo sono in misura irrisoria
– Gli idrocarburi non saturi sono maggiormente adsorbibili rispetto agli idrocarburi saturi specialmente se vi sono doppi legami coniugati
– In presenza di composti organici contenenti gruppi funzionali l'affinità per l'adsorbimento aumenta all'aumentare della polarità del gruppo funzionale
Prestazioni
Le prestazioni della cromatografia su strato sottile e i suoi risultati analitici possono essere espressi tramite parametri caratteristici quali:
- Selettività ovvero la capacità della capacità del sistema di separare i componenti della miscela; essa è funzione della diversa distanza percorsa dai componenti della miscela durante la fase di eluizione ed è espressa dal fattore di ritenzione Rf (Ritenction Factory) definito come: Rf = di/del
Dove di rappresenta la distanza percorsa dall'i-esimo componente del sistema e del è la distanza percorsa dall'eluente. E' da notare che Rf è un numero puro e sempre minore di uno
- Efficienza ovvero la capacità del sistema a mantenere compatta la macchia fino al termine dell'eluizione. In caso contrario, infatti, macchie che si diffondono lateralmente, diventando larghe e con i bordi sfumati rendono problematica la valutazione di Rf
- Risoluzione ovvero la capacità del sistema cromatografico di produrre macchie ben separate e non sovrapposte nemmeno in parte
- Capacità ovvero la quantità massima di campione che può essere depositata sulla linea di partenza; se la capacità è superata si ottengono macchie regolari ma con deformazioni di vario genere
- Riproducibilità ovvero la capacità di ottenere valori di Rf molto vicini per la stessa sostanza in prove successive. Quest'ultimo è un fattore critico dovuto a una serie di cause che devono essere controllate come la natura dell'adsorbente e lo spessore dello strato
