La cromatografia liquida ad alta prestazione nota con l’acronimo di HPLC dall’inglese High Performance Liquid Chromatography serve a separare e caratterizzare sia qualitativamente che quantitativamente i componenti presenti in una miscela presente in soluzione.
La tecnica sfrutta l’equilibrio di affinità dei vari componenti tra una fase stazionaria posta all’interno di una colonna e una fase mobile che fluisce attraverso essa.
Strumentazione
Gli elementi costitutivi dell’apparecchiatura della cromatografia HPLC sono:
- Contenitori per la fase mobile in cui si trovano i solventi che, devono essere puri e pertanto i contenitori sono integrati con degasatori, distillatori e sistemi di filtraggio.
- Pompe che possono essere pompe alternative a pistone, pompe a siringa e pompe pneumatiche
- Sistemi di introduzione del campione. Il campione è iniettato nella colonna da un iniettore in grado di gestire volumi di campione compresi tra 0,1 e 100 mL ad alte pressioni
- Colonna normalmente realizzata in acciaio inossidabile e sono lunghe 50 – 300 mm con un diametro interno di 2 – 5 mm.
- Riempimento della colonna che è impaccata con la fase stazionaria. Essa può a sua volta essere polare come la silice o apolare come idrocarburi a lunga catena fatti adsorbire dalla silice.
- Rivelatori che possono essere di vari tipi tra cui rivelatori ad assorbanza, a serie di diodi, elettrochimici, a fluorescenza e a spettrometro di massa. Il segnale proveniente dal rivelatore viene ricevuto dai registratori che sono utilizzati per elaborare, archiviare e riprodurre dati cromatografici.
La fase mobile può essere di tipo non polare come, ad esempio, n-esano o di tipo polare come, ad esempio, etanolo.
Il solvente è fatto fluire tramite l’impiego di pompe che permettono la circolazione della fase mobile, ne mantengono il flusso e la pressione durante l’analisi.
Tramite una siringa è iniettata nella colonna una piccola quantità di campione che viene spinto ad
attraversare la fase stazionaria dalla fase mobile applicando pressioni dell’ordine delle centinaia di atmosfere.
I componenti della miscela sono separati sulla base delle loro interazioni con le particelle della fase stazionaria e identificati dal rivelatore che fornisce il cromatogramma
Applicazioni
L’HPLC è utilizzato in campo chimico, biochimico o farmaceutico per:
- Analisi qualitativa e separazione di composti come farmaci, sali, proteine, medicinali a base di erbe
- Analisi quantitativa per determinare la concentrazione di un componente
- Preparazione di sostanze pure per studi clinici e tossicologici
- Analisi delle tracce di componenti presenti in concentrazioni molto basse come inquinanti nelle analisi ambientali
- Analisi di miscele polimeriche