Nitrogenasi

La nitrogenasi è un complesso enzimatico che svolge un ruolo rilevante in campo agricolo in grado di convertire l’azoto molecolare presente nell’atmosfera in ammoniaca e composti azotati, nutrienti che supporta la crescita cellulare.

La nitrogenasi appartiene quindi alla classe delle ossidoreduttasi classe di enzimi che catalizzano le reazioni di ossidoriduzione ovvero quelle reazioni in cui una specie detta riducente cede elettroni a una specie detta ossidante.

Oltre a convertire l’azoto in una forma assimilabile dal terreno, la nitrogenasi è anche in grado di produrre contemporaneamente idrogeno molecolare come sottoprodotto della reazione:
N₂ + 8 H⁺ + 8 e^– + 16 ATP → 2 NH₃ + 16 ADP + 16 P_i+ H₂

Affinché tale reazione  che comporta la rottura del triplo legame azoto-azoto possa avvenire occorre un grande dispendio di energia pari a 9.42 ·10⁵ kJ mol^–1 di N fissato. La riduzione dell’azoto può avvenire anche al di fuori della fase biotica ad opera della nitrogenasi, ma a velocità inferiore.

I fulmini, ad esempio, possono rompere la molecola di azoto con formazione di nitrati e le acque meteoriche possono apportare al terreno discrete quantità di composti azotati. D’altra parte l’idrogeno può essere ottenuto anche grazie all’azione del complesso enzimatico delle idrogenasi che appartengono alla classe delle ossidoreduttasi

La nitrogenasi è presente in batteri azoto fissatori, nei cianobatteri organismi unicellulari in grado di utilizzare l’acqua come fonte di elettroni e di produrre ossigeno molecolare e nei batteri simbionti che colonizzano un determinato organismo apportandogli un certo vantaggio.

Tipi

Da un punto di vista genetico vi sono quattro nitrogenasi geneticamente distinte, tre delle quali sono strettamente correlate, che presentano una composizione simile di cofattori metallici e subunità proteiche. Sebbene ogni enzima abbia un eterometallo diverso ovvero Mo, V o Fe, sono così simili che si presume siano derivati ​​da un antenato comune.

Al contrario, la quarta e finora unica nitrogenasi, che è stata isolata dall’organismo termofilo, Streptomyces thermoautotrophicus, è così diversa che potrebbe benissimo essere stata un complesso enzimatico ottenuto dall’evoluzione della specie.

La regolazione dell’espressione della nitrogenasi nei batteri dipende dalla disponibilità di molibdeno, vanadio o ferro nel mezzo e infatti gli enzimi contenenti molibdeno, vanadio o ferro non sono distribuite equamente in natura. Sulla base dell’architettura simile, ci si potrebbe aspettare che seguano un meccanismo catalitico generale. Tuttavia, in condizioni di 1 atm N 2 e di elevato flusso di elettroni, vengono prodotte diverse quantità di idrogeno per mole di azoto ridotto.

La più studiata dei tre enzimi correlati, maggiormente distribuita in natura è la Mo-nitrogenasi, enzima complesso contenente un sito attivo in cui un cluster metallico Mo-Fe-S coordina un piccolo atomo centrale X (C, N o O) sulla cui superficie vi sono atomi di Fe e Mo.

Mo-nitrogenasi

Le Mo-nitrogenasi che si trovano in tutti i diazotrofi, microrganismi che fissano l’azoto gassoso atmosferico in una forma biologicamente più utile, sono costituite da due componenti proteiche: la proteina MoFe e la proteina Fe.

La proteina Fe è un omodimero contenente un cluster Fe₄S₄ responsabile del trasferimento di elettroni alla proteina MoFe in un processo dipendente da ATP. La proteina MoFe presenta una struttura tetramerica α₂β₂ e contiene due coppie di centri metallici, il cluster P (Fe₈S₇)  e i centri cofattore MoFe (MoFe₇S₉) che costituiscono i siti di legame e riduzione dell’azoto.

Il cofattore FeMo è situato nella subunità α ed è legato covalentemente alla proteina da una cisteina e un residuo di istidina. Inoltre, esistono diversi legami a idrogeno tra la proteina e vari ligandi di zolfo del cofattore. Il cluster P si trova tra le subunità α e β ed è collegato da tre residui di cisteina a ciascuna subunità. La reazione di fissazione dell’azoto catalizzata da questo enzima può essere scritta:

N₂ + 10 e⁻ + 10 H⁺ + 20 MgATP → 2 NH₃ + 2 H₂ + 20 MgADP + 20 P_i
in cui MgATP è un sale di magnesio costituito da Mg²⁺ e ATP^2-

V-nitrogenasi

La V-nitrogenasi è un enzima chiave alternativo presente nei batteri azotofissatori ed è impiegata per la fissazione dell’azoto quando il molibdeno non è disponibile, ovvero i geni che la codificano sono espressi solo in condizioni di carenza di molibdeno.

Poiché la maggior parte delle funzioni della V-nitrogenasi corrispondono a quelle delle più comuni Mo-nitrogenasi, esse servono quindi come percorso alternativo per la fissazione dell’azoto in condizioni di carenza di molibdeno. È quindi considerata un componente importante del ciclo dell’azoto che converte l’azoto gassoso in ammoniaca, rendendo così disponibile alle piante l’azoto altrimenti inaccessibile.

È composta da una proteina V-Fe tetramerica con una struttura α₂β₂ contenente due atomi di vanadio, 23 atomi di ferro e 20 atomi di zolfo, e una proteina dimerica con una struttura γ₂ contenente quattro atomi di Fe e quattro atomi di zolfo per dimero.

La V-nitrogenasi è meno efficace nel fissare l’azoto rispetto al complesso enzimatico contenente molibdeno a temperatura ambiente perché converte una quantità maggiore di H⁺ in H₂ come reazione collaterale. Tuttavia, a temperature più basse il complesso catalitico di vanadio è risultato più attivo rispetto a quello contenente molibdeno e a temperature basse fino a 5 °C la sua attività di fissazione dell’azoto è 10 volte superiore.

Come la Mo-nitrogenasi, può essere facilmente ossidata ed è quindi attiva solo in condizioni anaerobiche. La reazione di fissazione dell’azoto catalizzata da questo enzima può essere scritta:
N₂ + 18 e⁻ + 18 H⁺ + 36 MgATP → 2 NH₃ + 6 H₂ + 36 MgADP + 36 P_i

Fissazione dell’azoto

Il ciclo dell’azoto si compone di diverse fasi di cui la prima è la fissazione dell’azoto (BNF) cui segue la nitrificazione, l’assimilazione, l’ammonificazione ed infine la denitrificazione. La fissazione dell’azoto è un processo in cui l’azoto dall’aria è ridotto a ammoniaca o ione ammonio, che può essere ulteriormente convertito in composti organici contenenti azoto, come proteine ​​e acidi nucleici.

In genere, la fissazione dell’azoto avviene tramite processi naturali da parte dei batteri come, ad esempio, Azotobacter,  Rhizobium,  Azospirillum e  Cyanobacteria. La fissazione  avviene con la conversione dell’azoto in ammoniaca catalizzata dalla nitrogenasi.

Affinché la reazione possa avvenire è necessaria energia che viene fornita dall’idrolisi dell’ATP pertanto la semireazione di riduzione si accoppia con l’idrolisi di 16 equivalenti di ATP. Gli enzimi che costituiscono la nitrogenasi vengono distrutti dall’ossigeno e pertanto molti degli organismi che fissano l’azoto utilizzano l’ossigeno come accettore terminale per la respirazione.

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