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La cromatografia liquido-solido su colonna: istruzioni per l’uso


La cromatografia liquido-solido fa uso di due fenomeni di ripartizione: l’adsorbimento e lo scambio ionico. Per quanto la cromatografia di adsorbimento e quella di scambio ionico differiscano notevolmente sia per ciò che riguarda la natura delle forze di ripartizione sia per quanto attiene le loro applicazioni, ambedue hanno in comune l’uso della tecnica di eluizione in colonna. La cromatografia di adsorbimento è una tecnica in cui una corrente di liquido provoca la migrazione differenziale dei composti di una miscela, a partire da una stretta zona iniziale, in un mezzo poroso dotato di proprietà adsorbenti. La più elementare colonna per cromatografia è costituita da un tubo di vetro la cui forma e dimensioni sono determinate dalla sostanza da  esaminare e, di riflesso dalla quantità di materiale adsorbente che deve essere caricato. Quando si opera con quantità molto piccole di sostanza si utilizzano i microtubi con diametro interno di 1-5 mm e di altezza 10-12 cm muniti nella parte inferiore di una strozzatura dove è posto un batuffolo di lana di vetro per trattenere l’adsorbente.

La separazione di quantità consistenti di sostanze richiede colonne più capaci, di solito lunghe e sottili, con rapporto altezza/ diametro compresi tra 10 e 20. Il materiale adsorbente è sostenuto da un setto poroso. Per facilitare l’immissione del liquido i tubi sono muniti di serbatoio ad ampolla direttamente saldato o di un giunto a smeriglio che permette l’applicazione di un opportuno recipiente. Tutti i rubinetti o gli smerigli devono essere privi di grasso o moderatamente lubrificati per evitare l’inquinamento della soluzione. In ogni caso si deve evitare che la parte superiore della colonna rimanga priva di liquido. L’estremità inferiore del tubo è normalmente fornita di un rubinetto che regola il flusso dell’eluato nel recipiente di raccolta.

In figura si possono vedere vari tipi di colonne:

 cromatografy

L’adsorbente può essere introdotto nella colonna a secco o a umido. Il caricamento della polvere secca deve essere fatto a piccole porzioni; per rendere più omogenea la distribuzione del materiale si può scuotere lateralmente la colonna o spingere l’adsorbente verso il basso mediante un disco attaccato ad un’asta. Prima dell’impiego la colonna deve essere bagnata con il solvente che verrà usato per preparare la soluzione da cromatografare: una buona impregnazione può essere raggiunta facendo preventivamente il vuoto nel tubo in modo da eliminare le bolle d’aria.

Nel riempimento a umido il materiale adsorbente viene dapprima sospeso nel solvente e quindi introdotto come pasta liquida a porzioni nella colonna. Una regolare sedimentazione viene facilitata scuotendo la colonna o applicando una leggera depressione il che consente di eliminare l’eccesso di solvente. E’ consigliabile lasciare defluire il solvente durante il caricamento in modo da evitare la formazione di gorghi con conseguente stratificazione irregolare.

Con questa tecnica la formazione di bolle d’aria è molto ridotta, ma può intervenire una sedimentazione differenziale dovuta alla non omogenea granulazione del materiale.

Ciò può portare a differenze locali nel potere adsorbente; è consigliabile quindi usare materiali a granulazione uniforme in sospensione piuttosto densa.

Per rendere minima la diffusione durante lo sviluppo del cromatogramma, è necessario che la banda, che si forma sotto la testa della colonna dopo che si è introdotta la soluzione sia molto stretta. E’ opportuno pressare la parte superiore del materiale così da ottenere uno strato compatto oppure proteggere la superficie con un dischetto di carta da filtro o con lana di vetro o con cotone idrofilo. E’ anche necessario mantenere continuamente sopra l’estremità superiore della colonna uno strato di solvente: prima di introdurre la soluzione da cromatografare si fa scorrere il solvente nella colonna fino a che emergono le prime gocce avendo cura che la colonna non vada a secco.

La soluzione contenente le sostanze da separare, a concentrazione piuttosto elevata, ma tale da non dar luogo a precipitazione del solido nella colonna, è introdotta tramite una pipetta la cui punta viene appoggiata alla parete il più vicino alla parete dell’adsorbente: in tal modo la sostanza si distribuisce in strato sottile ( 1-2 mm) garanzia per un accurato e soddisfacente sviluppo.

Il solvente di sviluppo viene caricato nella parte superiore della colonna: aprendo il rubinetto di collegamento con il recipiente di raccolta il solvente defluisce verso il basso trasportando le sostanze con velocità diverse con conseguente migrazione differenziale delle bande che si dispongono lungo la colonna come si può vedere in figura:

 column-chromatography-process

lo sviluppo potrà dirsi completo quando le zone sono completamente separate. Le sostanze sono recuperate alla base della colonna per continua aggiunta di solvente: le frazioni sono raccolte in una serie di recipienti mediante un collettore di frazioni che solitamente è automatico ed esaminate singolarmente con metodi chimici o fisici.

Un adsorbente ideale deve essere in grado di adsorbire un gran numero di sostanze con un’elevata capacità di adsorbimento in modo da non risultare saturato da soluzioni troppo diluite. Il suo potere adsorbente deve essere riproducibile, controllabile e modificabile con semplice operazioni di disattivazione. Inoltre non deve adsorbire irreversibilmente il soluto, né reagire con esso o catalizzare reazioni di decomposizione; infine deve essere insolubile nell’eluente e permettere una ragionevole velocità di percolamento.

L’allumina ( Al2O3) si avvicina a questo tipo ideale di materiale adsorbente tanto da risultare il più usato. Tra le altre sostanze adoperate ricordiamo: la silice, i silicati naturali o sintetici, il carbone attivo, gli ossidi metallici, i sali precipitati.

Il potere adsorbente di un materiale può essere variato con trattamenti attivanti o disattivanti. In generale l’attivazione di un adsorbente ( eccetto il carbone) consiste nella diminuzione della quantità d’acqua adsorbita; l’aumento della quantità d’acqua fissata sui centri d’adsorbimento dà luogo a una disattivazione. Il potere adsorbente dipende quindi, a parità di altri fattori, dal tenore di acqua libera, cioè quella parte di acqua che può essere fissata o eliminata reversibilmente.

Per ridurre l’attività generalmente elevata del carbone si ricorre ai cosiddetti saturatori, cioè a sostanze che siano fortemente adsorbite sui centri attivi. I saturatori più usati sono: gli alcooli, gli acidi grassi ( stearico, oleico), le lecitine.

I solventi che possono essere usati come eluenti sono svariati. Ciascun solvente è caratterizzato da un potere eluente che dipende dalla natura del solvente stesso oltre che dall’adsorbente, dalla sostanza da eluire e dalla temperatura.

In tabella vengono riportate le tre serie classiche dove i solventi sono elencati in ordine di potere eluente crescente.

La serie Trappe, nota come serie eluotropa si basa sul confronto delle diverse proprietà fisiche dei solventi ed è molto utile nella separazione dei lipidi.

La serie di Reichstein è stata ricavata dalla cromatografia degli steroidi mentre la serie di Jacques e Mathieu è basata sulla costante dielettrica: secondo questi autori il potere eluente di un solvente è proporzionale alla costante dielettrica perché i solventi agiscono come eluenti in quanto essi stessi vengono adsorbiti; generalmente in una miscela è più facilmente adsorbito e quindi manifesta potere eluente più marcato il solvente che ha costante dielettrica maggiore.

La serie di potere eluente nei solventi

Serie di Trappe Serie di Reichstein Serie di Jacques e Mathieu
Etere di petrolio Etere di petrolio Cicloesano
Cicloesano
Tetracloruro di carbonio
Tricloroetilene
Toluene
Benzene Benzene Benzene
Diclorometano
Cloroformio
Etere anidro Etere anidro Etere anidro
Acetato d’etile Cloroformio Cloroformio
Acetone Acetone Acetato d’etile
1 -propanolo Dicloroetano
Etanolo Butan-2-olo
Metanolo Metanolo Acetone
Acqua Acetato d’etile Etanolo
Acido acetico glaciale Metanolo

Esistono poi tutte le possibili miscele binarie con le quali si può disporre di una vasta gamma di poteri eluenti; nell’uso pratico saranno in definitiva saggi preliminari e esperienza a determinare il miglior solvente o la migliore miscela che conviene utilizzare per una certa separazione.

 

Autore: Chimicamo

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